Principe de la PCR (Polymerase Chain Reaction)

 

La PCR est une technique de copiage moléculaire ou d’amplification.On utilise des chaines de nucléotides spécifiques appelées amorces, qui sont des entités indispensables à la réalisation de la PCR. Elles se placent aux extrémités de la zone à copier afin de délimiter le cadre de copiage. Le brin d’ADN copié peut ensuite lui même servir de modèle pour une PCR. La PCR se déroule comme une série de cycles de copiage. 30 cycles de copiages donnent 1 milliard de copies de l’ADN originel. Un cycle de copiage multiplie par deux la quantité d’ADN modèle. Une ADN polymérase est une enzyme de copiage d’ADN qui permet d’accrocher des nucléotides les uns aux autres à partir d’un brin d’ADN comme modèle. L’enzyme a besoin d’une amorce. La PCR nécessite :
-deux amorces.

-des nucléotides libres.

-diverses substances assurant un environnement de travail optimal de l’enzyme(pH et ions Mg2+).

Chaque cycle de copiage est constitué de 3 étapes :

-la première étape consiste à séparer les doubles chaînes d’ADN. C’est la dénaturation qui est obtenue à une température d’environ 95°C.

- Lors de la deuxième étape, la température doit s’abaisser suffisamment ( 55 à 60°C) afin que les amorces puissent s’hybrider aux parties de l’ADN qui lui sont parfaitement complémentaires. C’est l’étape d’hybridation.

- A la troisième étape, l’ADN polymérase effectue son travail d’assemblage des nucléotides des nouvelles chaines à construire. C’est l’étape d’élongation.

 

L’ADN polymérase :

L’ADN polymérase est une enzyme c'est-à-dire une protéine qui prend un arrangement tridimensionnel subtil et fragile. Dans la première étape de la PCR, l’ADN polymérase est élevée à une température de 95°C. A cette température, la structure tertiaire de l’enzyme est modifiée donc l’enzyme est dénaturée. Cela veut dire que chaque cycle de PCR nécessite un ajout d’enzyme polymérase. Cependant, des bactéries parviennent à vivre dans des sources thermales à plus de 100°C. Elles ont pour cela développé un arsenal de protéines, d’enzymes et donc une ADN polymérase résistante à de telles températures. L’ADN polymérase la plus couramment utilisée fut découverte dans la bactérie Thermus aquaticus d’où la dénomination Taq polymérase. Cette polymérase résiste à des températures élevées, supprimant la nécessité d’en rajouter à chaque cycle.

 

Les amorces :

Les amorces déterminent la spécificité de la PCR (endroit de la PCR à copier). Il faut que la séquence de nucléotides des amorces puisse s’hybrider à la zone d’ADN à copier mais nulle part ailleurs. Une amorce doit avoir un certain nombre de nucléotides afin de réduire les chances de correspondances de copier une autre zone de l’ADN que celle voulue (15 nucléotides=1 chance sur 1 milliard de ne pas avoir ce que l’on souhaite). La conception des amorces nécessaires nous oblige à connaître au préalable la séquence de nucléotides de la zone d’ADN que l’on souhaite copier.

 

 

  Machine à PCR

 

Schéma représentant l'action de la PCR