TP : L'ÉLECTROPHORÈSE D'ADN  :

(photos et schémas en bas de page)

(Les photo de l'expérience)

 

1.      Preparation du TP :  

 

Préparation du tampon TBE :

Diluer 10x les 100 mL de tampon dans un flacon d'1 L en rajoutant 900 mL d'eau distillé.

Préparation du gel d'agarose :

Transvaser les 1,6 g d'agarose dans un flacon passant au micro-onde et y rajouter 120 mL de tampon TBE. Placer le tout au micro-onde à 1000W pendant 2 à 3 minutes. Surveiller toutes les 30 secondes l'état de la solution jusqu'à qu'elle soit transparente et sans grumeaux. Faire refroidir le tout.

Coulage des gels :

Couler le liquide dans les moules à électrophorèse puis y placer le peigne afin d'y avoir des puits. Laisser refroidir jusqu'à solidification. Puis démouler les puits et placer le moule dans la cuve à électrophorèse.

Préparation de l'azur A (le colorant) :

Préparer une solution d'ethanol à 20% en diluant 80 mL d'ethanol pur dans 320 mL d'eau distillée dans une éprouvette graduée.

Verser le sachet d'Azur A dans un flacon et y ajouter les 400 mL d'ethanol à 20%.  

 

2.      Manipulation :  

 

Prélever à la micro-pipette 10 µL de bleu de dépôt et le placer dans un micro-tube contenant l'ADN du phage λ (individu 1). Recommencer l'opération avec le tube contenant l'ADN de phage λ muté (individu2), celui de phage λ digéré par HindIII et celui de phage λ muté digéré par HindIII .

Pour remplir les puits, prelever 12 µL de chaque solution pour les placer dans les puits en notant bien leur emplacement. Remplir un cinquième puit avec une des solutions utilisées précédemment. Dans le cadre de notre TPE, l'ADN placé deux fois serait celui du suspect ainsi que celui de l'individu coupable (évidemment ils seront identiques). Utiliser l'ADN de phage λ non muté digéré par l'enzyme HindIII considéré comme l'ADN x (inconnu).

Lancer immédiatement l'électrophorèse pour éviter que les dépôts diffusent dans le gel.

Pour cela, fermer le couvercle et brancher la cuve. Régler la tension a 70 V.

Laisser migrer ¾ d'heure à 1h30.

Une fois la migration terminée, retirer le gel de la cuve en faisant attention à ne pas le casser car le gel est fragile. Rincer le gel à l'eau distillée puis le placer dans un récipient et le recouvrir du colorant préparé précédemment. Laisser le gel dans ce bain pendant 5 minutes environ puis le rincer dans un bain d'eau ou sous l'eau courante (si le gel est très coloré, éliminer l'excès de colorant avec quelques mL d'alcool à 70% puis éliminer cet alcool à l'eau du robinet jusqu'à ce que l'eau soit translucide)

On devrait voir apparaître des bandes sur le gel au bout de quelques minutes mais l'intensité maximale de la coloration s'observera au bout de quelques heures, voire quelques jours.  

 

3.      Interprétation de nos résultats (modélisation simplifiée de l'identification génétique):  

 

L'électrophorèse de l'ADN des phages λ mutés et non mutés non digérés a donné pour chacun une bande à une distance identique, car la longueur de l'ADN de chaque phage est identique (48 502 paire de bases). On en déduit la nécessité de les faire digérer par une enzyme pour les distinguer l'un de l'autre.

Donc on fait digérer l'ADN des phages λ mutés et non mutés par l'enzyme HindIII qui découpe l'ADN (voir site de restriction).

Pour le phage λ non muté, on obtient sept fragments de longueurs différentes (voir électrophorèse), donc il y a eu six sites de restriction (schéma carte de restriction).

Pour le phage λ muté, on obtient huit fragments de longueurs différentes (voir électrophorèse), donc il y a eu sept sites de restriction (schéma carte de restriction), un de plus que pour l'ADN de phage λ non muté, un fragment de 9416 paires de nucléotides a été découpé en deux fragments de respectivement 6019 et 3397 paires de nucléotides. Ainsi il est donc possible de distinguer les deux ADN à l'aide du nombre de fragments obtenus.

Pour l'individu x, on constate que l'on obtient sept fragments, donc sept sites de restriction pour l'enzyme HindIII, comme pour l'ADN de phage λ non muté. Ces fragment ont migré de la même façon que les fragments d'ADN de l'ADN de phage λ non muté (individu 1), donc l'individu x correspond à l'ADN de l'individu 1.

   

 

Cartes de restriction de l'enzyme HindIII sur les phages λ non mutés et mutés.

 

 

On s'aperçoit que le phage λ muté possède une zone de restriction supplémentaire par rapport au phage λ non muté, ce qui explique la bande noire supplémentaire sur l'électrophorèse.

 

Site de restriction de l'enzyme HindIII et le profil de coupure

 

 

 

 

Résultats obtenus lors de l'électrophorèse des individus 1 (phage λ non muté) et 2 (phage λ muté)

 

 

Si l'on observe les électrophorèses des phages λ non muté et muté digérés par l'enzyme, on s'aperçoit bien d'une bande supplémentaire sur celle du phage λ muté. Et si on observe la longueur des fragments, on voit nettement que le deuxième de l'ADN du phage λ non muté a un nombre de paires de bases égal à l'addition des 3^ème et 5^ème fragments de l'électrophorèse de l'ADN du phage λ muté. Tous les autres fragments ont des tailles identiques sur les deux électrophorèses.

 

Résultats obtenus lors de l'électrophorèse de l'individu x (modélisé donc par le phage λ non muté)

 

 

Si on regarde l'électrophorèse de l'ADN de cet individu digéré par l'enzyme HindIII, on remarque que les tailles des différents fragments et leurs distances de migration sont identiques à celle du phage λ  non muté. Nous pourrons donc en conclure que c'est le même ADN qui a été utilisé pour la migration (ce qui est effectivement le cas)